Инфекция ожоговой раны (клиническое, морфологическое и бактериологическое исследование)

Крутиков М.Г.
Пальцын А.А.
Бобровников А.Э.
Колокольчикова Е.Г.
Червонская Н.В.
Бадикова А.К.
Гришина И.А.

Институт хирургии им. А.В.Вишневского РАМН.
г.Москва

Морфологическое исследование ран послужило основой для формирования основных понятий о раневом процессе. В то же время для суждения об инфицировании ожоговых ран в настоящее время в клиниках чаще ограничиваются результатами бактериологических анализов (А.А.Алексеев, М.Г.Крутиков, В.П.Яковлев, 1997; R.Herruzo-Cabrera, V.Garcia-Torres, J.Garcia-Caballero et all., 1997; A.H.Kamel, E.A.Elmegeed, 1997), а морфологическое исследование производят значительно реже (B.A.Pruitt et all, 1993). Причиной этого являются, с одной стороны, большая трудоемкость морфологического исследования, с другой — возможность при бактериологическом исследовании определить как вид возбудителя, так и его чувствительность к антибактериальным препаратам, что представляется клинически более ценным.

Исследования McManus в 1981 г. показали, что количественное увеличение обсемененности микроорганизмами ожоговой раны, превышающее 105 микробных тел на грамм ткани, считается только показателем возможности ее инфицирования, но еще не является диагнозом, и коррелирует с гистологическим доказательством инвазии ожоговой раневой инфекции менее, чем в 50% биопсий. Основным и самым информативным для диагностики инвазивной инфекции является гистологический метод исследования раневых биопсий (S.H.Kim et all., 1983; G.D.Neal et all., 1981; B.A.Pruitt et all, 1993)

Принято считать, что все ожоги либо первично инфицированы, либо бактериальная обсемененность наступает уже в первые часы после травмы (В.В.Бирюкова, 1951; R.Z.Wu, 1991). Условно-патогенная микрофлора, как показали ранее выполненные в Институте исследования, обнаруживается на ожоговой поверхности уже в 1 сутки после травмы (М.И.Кузин с соавт., 1982). Однако выделенный из раны микроб может оказаться не возбудителем инфекции, а представителем микрофлоры, колонизирующей рану, что способно привести к неадекватному назначению больному антибактериальных препаратов (А.А.Пальцын с соавт., 1996).

В 1993 г. B.A.Pruitt с соавт. были опубликованы результаты гистоморфологического исследования биоптатов ожоговых ран и предложена классификация по стадиям развития инфекционного процесса. В этой классификации выделены следующие патогистологические стадии развития инфекции в ожоговой ране.

С целью изучения информативности существующих методов исследований инфекции ожоговых ран в научно-практическом центре термических поражений Института хирургии им. А.В.Вишневского были проведены исследования биоптатов ожоговых ран морфологическими, в том числе авторадиографическими, и бактериологическими методами.

Основными задачами исследования стало сравнение микробиологических данных о виде и числе возбудителей с патогистологическими признаками инфекции ожоговых ран на основании изучения локализации микроорганизмов в тканях и реакции различных клеточных элементов и раны в целом на присутствие микрофлоры с клинической картиной течения заболевания. При этом учитывалось количество совпадений увеличения микробной обсемененности ожоговых ран более 105 м.т. в г ткани с подтверждением микробной инвазии при гистологическом и авторадиографическом исследованиях. Последнее позволяет определить не только локализацию и количество микроорганизмов, но и их жизнеспособность (по синтезу РНК) и способность размножаться в организме или даже внутри клеток (по синтезу ДНК).

Материалы и методы исследования

Проведено 65 гистологических исследований биоптатов глубоких ожоговых ран у 35 больных (от 1 до 4 анализов у одного больного, из 13 участков одновременно) в предоперационном периоде на различных стадиях ожоговой болезни. Исследуемую группу составили 7 женщин и 28 мужчин в возрасте от 15 до 60 лет (средний возраст 39,6+2,08 лет), общая площадь поражения составляла от 1 до 60% поверхности тела (в среднем 27,9+2,07%), при этом площадь глубоких ожогов занимала от 1 до 40% поверхности тела (в среднем 14,2+1,33%).

Для анализа результатов исследования использована классификация стадий развития инфекционного процесса в ожоговой ране, предложенная B.A.Pruitt с соавт. в 1993 г.

Для гистологического исследования полученный биопсийный материал фиксировали формалином, заключали в парафин, окрашивали гематоксилином и эозином. Для проведения электронно-радиоавтографического исследования полученные биоптаты помещали в питательную среду 199, в лабораторных условиях разделяли на кусочки объемом 1 мм3 и инкубировали в течение 60 мин. при температуре 37оС часть с 3Н-тимидином в дозе 20 мкКи/мл, а остальные 3Н-уридином в дозе 100 мкКи/мл, после инкубации отмывали от невключившегося радиоактивного предшественника и фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида и 1% раствором четырехокиси осмия, обезвоживали и заливали в смесь эпона и аралдита. Все кусочки, залитые в блоки эпоксидной смолы, использовали для приготовления радиоавтографов просматриваемых в световом микроскопе (эмульсия ЗАО НПО «ФоМос», экспозиция 3 суток, проявитель Д-19). По результатам анализа свето-микроскопических радиоавтографов затачивали пирамидки для ультратомии. Электронно-микроскопические радиоавтографы готовили по описанной ранее методике (А.А.Пальцын,1996). Количественное изучение содержания микробов в 1 грамме ткани проводили по классической методике, предложенной C.Teplitz et all. (1964), используя для анализа количественный показатель микробной обсемененности, представленный в виде десятичного логарифма числа колониеобразующих микробных единиц на 1 гр ткани раны (Lg КОЕ/гр.тк.). Микроорганизмы идентифицировали общепринятым методом, изложенным в методических рекомендациях (1984).

Результаты исследования

Анализ результатов гистологических исследований биопсий ожоговых ран показал, что в первые 5 суток после травмы в период шока и начала токсемии наблюдался резкий отек и пропитывание кровью дермы, демаркационный вал отсутствовал, были обнаружены небольшие по площади инфильтраты, содержащие нейтрофиллы в области сохранившихся волосяных фолликулов. У 6 из 8 (75%) обследованных в этот период больных микроорганизмы определялись лишь на поверхности струпа (IA стадия) (Рис. 1), у 2-х — обнаружена микробная инвазия, при этом степень микробной обсемененности ран, определенная бактериологическим методом, составляла в среднем 103 микробных тел в 1 грамме ткани.

Рис. 1. Срез обожженной кожи (увеличение — x 100, окраска — гематоксилин-эозин). Эпидермис не сохранен. Отек дермы. Демаркационный вал расположен над волосяным фолликулом. Инфильтрация дермы нейтрофиллами. (ожог IIIа степени). Микробы не найдены. (IА стадия).

У 4 из 8 больных (50%), двое из которых находились в стадии ожогового шока, а двое — сразу после выведения из состояния шока, клинических признаков инфекции не наблюдали. У этих больных микробиологическая обсемененность ран, определенная бактериологическим методом, не превышала в среднем 101,5 микробных тел в 1 грамме ткани.

Напротив, у 2 (25%) обожженных, обследованных после выведения из ожогового шока, несмотря на то, что микроорганизмы по данным гистологического и микробиологического исследований находили на раневой поверхности, а уровень обсемененности не превышал в среднем 102,5 микробных тел в 1 грамме ткани, отмечались клиниколабораторные признаки интоксикации в виде ухудшения общего состояния больных, повышения температуры тела, отрицательных сдвигов в клинических анализах крови, по всей видимости, связанные с всасыванием продуктов гистиогенного и микробного происхождения с ожоговой поверхности. Лихорадка не превышала 380С. Вместе с тем, нагноения ожоговых ран и воспаления неповрежденной кожи вокруг ожогов у этих больных не было отмечено.

У 2 (25%) обследованных больных в период ожогового шока при гистологическом исследовании раневых биопсий обнаружена микробная инвазия IB и IC стадий. При этом данные морфологического исследования коррелировали с клинической картиной наличия раневой инфекции и данными микробиологического исследования, при котором определялась степень обсемененности ожоговых ран выше 105 микробных тел в 1 грамме ткани. Эти больные с ожоговыми ранами на площади до 50% п.т., в том числе глубокими ожогами IIIб-IV степени 30% и 25% п.т., и сопутствующей тяжелой термоинголяционной травмой погибли в периоде токсемии от раннего сепсиса и пневмонии.

Таким образом, в начальный период ожоговой болезни отмечалась 100% корреляция данных гистологических и микробиологических исследований с клинической картиной заболевания.

Обнаружение микроорганизмов в подструпном пространстве на 6 — 12 сутки после травмы клинически совпадало с периодом начала нагноения и отторжения ожогового струпа. При морфологическом исследовании выявлена массивная инфильтрация нейтрофиллами, особенно в области формирования демаркационного вала. Под неотделенным или частично отслоенным струпом на поверхности дермы обнаружено большое количество микробов, которые проникали в некоторых участках и между волокнами дермы. Здесь, среди детрита, на границе некротизированной и живой ткани, в бактериях методом электронномикроскопической радиоавтографии выявлен синтез РНК и ДНК. Кроме струпа, микробы встречались на поверхности раны, между волокнами пропитанной отечной жидкостью и кровью дермы или в фагоцитированном виде в нейтрофилах сформированного демаркационного вала.

Патогистологическое исследование биопсий ожоговых ран в этот период выполнено у 15 больных. Только у 2 (13,3%) больных с ожогами на площади 7% и 10% поверхности тела, из которых 2% и 5% п.т. были, соответственно, глубокими, отсутствовали общие клинические и лабораторные признаки инфекции, микрофлора обнаруживалась на поверхности ран в небольшом количестве (в среднем 102,5 микробных тел в 1 грамме ткани). У 4 (26,7%) определялась микробная инвазия IB, IC, IIA и IIC стадий, при этом данные гистологического исследования совпадали с уровнем высокой обсемененности ожоговых ран (в среднем 106,75 микробных тел в 1 грамме ткани) и соответствовали клинико-лабораторным признаками инфекции (Рис. 2). У 3 (75%) из этих больных диагностирован сепсис. Один больной с обширными ожогами 60% п.т. (IIIб-IV — 40% п.т.), осложнившимися двусторонней пневмонией, погиб на фоне нарастающих явлений легочно-сердечной недостаточности.

У 9 (60%) обожженных при наличии выраженных клинико-лабораторных признаков инфекции по данным гистологического исследования микроорганизмы определялись только на поверхности. При этом уровень обсемененности в 4 случаях превышал «критический» — 105 микробных тел в 1 грамме ткани (в среднем 105,1). У всех этих больных наблюдали гипертермию выше 380С (температура тела в среднем составляла 38,1+0,20С). Один больной с обширными ожогами 45% п.т. (IIIб-IV степени — 30% п.т.) погиб на фоне развития пневмонии и раннего ожогового сепсиса.

Рис. 2. Срез обожженной кожи (увеличение — x 630, окраска — толуидиновый синий). Эпидермис отсутствует. Поверхностный слой дермы некротизирован, отделен демаркационным валом от сохранившегося глубокого слоя дермы. (Ожог IIIб степени). Бактерии (кокки) присутствуют в виде массивных скоплений в поверхностном (сосочковом) слое дермы, в фагоцитированном нейтрофиллами состоянии в демаркационном вале. (IIА стадия).

Таким образом, при гистологическом и микробиологическом изучении биопсий ожоговых ран у 50% больных выявлено соответствие увеличения уровня обсемененности ран более 105 м.т. в 1 гр ткани глубине микробной инвазии. Данные гистологических исследований совпадали с результатами микробиологических анализов и клинической картиной раневой инфекции у 6 больных (40% случаев). Клинико-лабораторные признаки наличия ожоговой инфекции у остальных больных, по всей видимости, были связаны с интоксикацией продуктами гистиогенного и, преимущественно, микробного происхождения. Микроорганизмы у этих пострадавших определялись только на ожоговой поверхности без признаков микробной инвазии.

Адекватное общее и местное лечение обожженных в большинстве случаев приводило к стиханию местных и общих признаков инфекции. В период 13-20 суток после ожога наблюдали полиморфизм ожоговых ран. На фоне сохраняющихся участков некроза имелись поверхности, покрытые яркими грануляциями. При гистологическом исследовании биопсий у 8 обследованных в этот период пациентов выявлено, что микроорганизмы определялись только на поверхности (IA стадия), т.е. отсутствовала инвазивная инфекция. Уровень микробной обсемененности колебался в широких пределах от 101 до 107 микробных тел в 1 грамме ткани, в зависимости от того, какой участок ожоговой раны попал в биоптат. При этом у 5 (62,5%) больных отмечены клиниколабораторные признаки инфекционного процесса, а уровень обсемененности ожоговых ран патогенной микрофлорой у них составлял в среднем 105 микробных тел в 1 грамме ткани. В 3 (37.5%) случаях клинические признаки инфекции отсутствовали, уровень микробной обсемененности составлял в среднем 103 микробных тел в 1 грамме ткани.

К концу 3 недели после травмы у 24 обследованных в этот период больных происходила эпителизации поверхностных и пограничных ожогов и выполнение глубоких ожоговых ран грануляциями. При морфологическом исследовании биопсий ожоговых ран IIIб степени спустя 21 день после травмы отмечалось появление на нижней границе демаркационного вала сосудов, что указывает на развитие грануляционной ткани. При благоприятном течении раневого процесса в грануляционной ткани увеличивалось количество новообразованных сосудов и соединительнотканных клеточных элементов. Особенно благоприятным, по нашим наблюдениям, признаком, указывающим на прекращение раневой инфекции и заживление раны, было появление молодых клеток жировой ткани. Вначале появлялись фибробластоподобные клетки с многочисленными жировыми вакуолями. Такие клетки приобретали способность к пролиферации — включали 3Н-тимидин, чего не было отмечено в период воспалительных изменений в ране. Наконец, обнаруживались зрелые адипоциты в виде перстневидных клеток.

Гистологическое исследование у 19 больных с «подготовленными» к операции ранами, выполненными «чистыми», мелкозернистыми грануляциями, показало отсутствие микроорганизмов в толще грануляций и под ними, единичные микробы встречались только на поверхности (IА стадия), то есть отмечено отсутствие инвазивной инфекции, а степень обсемененности ожоговых ран была в среднем менее 103 микробных тел в 1 грамме ткани. Только у 3 больных она превышала 105 микробных тел в 1 грамме ткани. У 11 (57,9%) больных не было клинико-лабораторных признаков инфекции, степень обсемененности ожоговых ран составляла в среднем 101,36 микробных тел в 1 грамме ткани. В 8 случаях (42,1%) выявлена клиническая картина инфекционного процесса: сохранялось нагноение ожоговых ран, умеренный лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формула влево и лихорадка. Температура тела не превышала 380С (составляя в среднем 37,2+0,240С). При микробиологическом исследовании отмечено некоторое повышение уровня обсемененности (в среднем 102,125 микробных тел в 1 грамме ткани).

У 5 из 24 обследованных больных отмечено неблагоприятное течение ожоговой болезни, клинически проявляющееся ухудшением общего состояния, прогрессированием ожогового истощения, гипертермией с отрицательными сдвигами в клинических анализах крови, бактериемией и кандидемией, отмечались изменения со стороны грануляций, которые истончались, становились ослизлыми, стекловидными, легко кровоточили, возникали фокусы вторичного некроза. По данным гистологического исследования было обнаружено, что образовавшаяся грануляционная ткань вновь подвергалась отеку, пропитывалась кровью, отмечался стаз крови в сосудах, наблюдалась интенсивная инфильтрация лейкоцитами, пролиферация местных клеточных элементов не определялась. Одновременно выявлено увеличение количества микроорганизмов на поверхности ожоговых ран с увеличением степени микробной обсемененности в среднем до уровня 104 микробных тел в 1 грамме ткани. Только у двух больных уровень обсемененности ожоговых ран был выше «критического». У 3 больных развился ожоговый сепсис, закончившийся летальным исходом у одного из них с обширными ожогами 60% п.т. (IIIб-IV степени — 40% п.т.). При этом клинико-лабораторная диагностика сепсиса только у одной из 3 этих больных подтверждалась данными гистологического исследования биопсий ожоговых ран, при которых была обнаружена грибковая инвазия IIB стадии: живые клетки рода Candida находили под слоем грануляций, и обсемененность при этом составляла 106 микробных тел в 1 грамме ткани. У остальных больных микроорганизмы определялись только на ожоговой поверхности (IА стадия).

Таким образом, корреляция данных гистологических и микробиологических исследований с клинической картиной заболевания в период после 21 суток заболевания отмечалась у 12 больных (50% случаев). Превышение микробной обсемененности ожоговых ран выше «критического» уровня совпадало с подтверждением микробной инвазии при патоморфологическом исследовании в 20% случаев.

Обсуждение

В результате проведенного исследования показано, что только в первые дни после травмы в периоде ожогового шока имелась 100% корреляция данных гистологического и микробиологического методов исследования. В течение заболевания на фоне лечения степень корреляции снижается. Так, в периоде токсемии только в 50% случаев эти данные совпадали. В дальнейшем в периоде септикотоксемии корреляция отмечается только в 20% случаев.

Следует подчеркнуть, что метод радиоавтографии при изучении инфицирования ран обладает большей разрешающей способностью, чем обычное морфологическое исследование, т.к. позволяет определить не только локализацию и количество микроорганизмов, но и их жизнеспособность (по синтезу РНК) и способность к размножению в организме или даже внутри клеток (по синтезу ДНК). Предварительная инкубация с 3Н-уридином позволяет пометить все жизнеспособные микробные клетки. Благодаря этому, при анализе радиоавтографов, в отличие от просматриваемого обычного среза, одиночная микробная клетка становится гораздо более заметной по скоплению над ней зерен серебра, черных в светлом поле и ярко светящихся отраженным светом в темном поле. Однако даже при использовании такого высокочувствительного метода обнаружения микроорганизмов — возбудителей раневой инфекции у больных с благоприятным общим и местным течением ожоговой болезни их не удалось найти ниже демаркационного вала.

При гистологическом исследовании раневых биопсий даже с применением высокоразрешающего метода радиоавтографии не было обнаружено микробов, а при микробиологическом исследовании находили, что их содержание в грамме ткани выражалось в log микробной обсемененности ожоговых ран более пяти. Маловероятно, чтобы при таком содержании бактерий в живых тканях возбудители инфекции не были обнаружены, хотя бы в виде одиночных клеток в радиоавтографах. Скорее всего, такие результаты бактериологического анализа связаны с тем, что в пробу попадали, наряду с живыми тканями, участки некроза либо имелось интенсивное микробное загрязненные поверхности биоптатов. В тех случаях, когда данные микробиологического исследования коррелировали с клиникой заболевания, отсутствие гистологического подтверждения инвазии может быть связано с полиморфизмом ожоговых ран, т.е. инвазия могла наблюдаться в зонах, не попавших в биоптаты.

Данные гистологического исследования коррелируют с результатами микробиологических анализов и клинической картиной наличия раневой инфекции в зависимости от стадии ожоговой болезни. Если в начальный период ожоговой болезни отмечалась 100% корреляция данных гистологических и микробиологических исследований с клинической картиной заболевания, то в дальнейшем такая зависимость снижается. В период ожоговой токсемии результаты лабораторных исследований совпадали с клинической картиной раневой инфекции только в 40% случаев. У остальных больных в этой стадии микроорганизмы определялись на ожоговой поверхности без признаков микробной инвазии, а клинико-лабораторные признаки интоксикации в виде ухудшения общего состояния больных, повышения температуры тела, отрицательных сдвигов в клинических анализах крови, по всей видимости, были связаны с всасыванием продуктов гистиогенного и микробного происхождения с ожоговой поверхности. В период подготовки ожоговых ран к операции (после 21 суток) данные этих исследований и клиническая картина заболевания коррелировали в 50% случаев. Следует отметить, что при отсутствии убедительных критериев инфекции по данным микробиологического и гистологического исследования основной для окончательного диагноза является клиническая оценка состояния ожоговой раны и общего состояния больного.

Наши данные показывают, что зачастую клиническая картина инфекции ожоговых ран связана не с выявлением в тканях микроорганизмов, а с соответствующей реакцией тканевых элементов на наличие некроза в ране. Морфологическими проявлениями такой реакции бывают: кровоизлияния в дерме, подкожно-жировой клетчатке и мышцах, тромбоз мелких сосудов, воспалительная реакция в виде клеточных инфильтратов в тканях, примыкающих к ожоговой поверхности, которые и создают условия для развития инфекционного процесса и его генерализации.

Полученные данные позволяет выделять 2 вида инфекционного процесса у обожженных — инвазивная и неинвазивная поверхностная инфекция. Такое разделение целесообразно с позиций определения лечебной тактики. При обнаружении инвазивной инфекции у больных показано проведение активной антибактериальной терапии с использованием препаратов как местно, так и парентерально, а хирургическая тактика должна быть направлена на уменьшение объема нежизнеспособных инфицированных тканей. В случае неинвазивного (поверхностного) характера инфекции основной акцент должен быть сделан на местную антибактериальную терапию ожоговых ран. Антибактериальные препараты при хирургических вмешательствах у таких больных должны назначаться с целью антибиотикопрофилактики послеоперационных инфекционных осложнений.

Выводы

Гистологический метод исследования биопсийного материала ожоговых ран для подтверждения инвазивной инфекции является достаточно информативным. Однако обнаружение микроорганизмов только на ожоговой поверхности не исключает ее инвазивный характер и генерализацию процесса. Истинная картина наличия или отсутствия признаков инфекции возможна только при комплексной оценке клинико-лабораторных данных. Комплексная диагностика особенно важна в период подготовки ран к хирургическому лечению для определения показаний к операции и выбора антибактериальных препаратов для профилактики и лечения инфекции.

Литература

1. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Яковлев В.П. Руссий мед. жур., 1997, №24, 1610-1616
2. Бирюкова В.В., Асептический метод лечения ожогов, автореф. дис., Л., 1951
3. Кузин М.И., Сологуб В.К., Юденич В.В. Ожоговая болезнь, М. «Медицина», 1982, 61
4. Пальцын А.А. Микробиологическая техника. Руководство для врачей и лаборантов. М.,1996, 271-283
5. Пальцын А.А., Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Колокольчикова Е.Г., Червонская Н.В., Бадикова А.К., Гришина И.А., Скуба Н.Д. Жур. микроб., зпид., иммунобиолог., 1996, №5, 84-86
6. Herruzo-Cabrera R., Garcia-Torres V., Garcia-Caballero J. et all. Ann. of Burns and Fire Disasters, 1997, V.10., №3, 146-151
7. Kamel A.h., Elmegeed E.A. Ann. of Burns and Fire Disasters, 1997, V.10., №1, 28-32
8. Kim S.H. et al. Use of frozen section technique for burn wound biopsies. Presented at 15th Annual Meeting of the American Burn Association, New Orleans, La, 1983;
9. McManus W.F., Gooidwin C.W. Burns wound infection. J. Trauma, 1981, 21, 9, 753-756
10. Neal G.D. et al. Burn wound Histoloric cultures. J. Burn Care Rehabil., 1981, 2, 35-39
11. Pruitt B.A., McManus A.T., Kim S.H. and Cioffi W.G.»Use of wound biopsies in the diagnosis and treatment of burn wound infection», US Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, USA. «Steinkopff Verlag Darmstadt», 1993, стр. 55-63
12. Teplitz C., Davis D., Walker H.S. Et all. Pseudomonas Burn Wound Sepsis. J. Surg. Research, 1964, 4, 5, 217-222
13. Wu R.Z. «Bacteriological investigation of burn blister fluid» Wu-han 3rd Municipal Hospital. Chung-Hua-Cheng-Hsing-Shao-Shang-Wai-Ko-Tsa-Chih. 1991 Mar; 7(1): 13-4, 73-4

РЕЗЮМЕ: Проведено сравнение микробиологических данных с патогистологическими признаками инфекции ожоговых ран и клинической картиной течения заболевания. В результате проведенного исследования показано, что в течение заболевания на фоне лечения степень корреляции клинико-лабораторных данных снижается. Истинная картина наличия или отсутствия признаков инфекции возможна только при комплексной оценке.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: инфекция ожоговой раны, патогистологическое исследование, биопсия.