Механизм и роль апоптоза при патологии: актуальность исследования в комбустиологии

Ушакова Т.А.
Карелин А.А.
Глоба А.Г.

Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Москва  

 

Программируемая клеточная гибель (ПКГ) или апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточной популяции в многоклеточном организме. Основой его функции является уравновешивание эффекта пролиферации клеток и элиминации поврежденных. Апоптоз служит молекулярным механизмом, обеспечивающим старение и смерть живого организма, что, возможно, не очень полезно для индивида, но чрезвычайно важно для стабильности популяции (Скулачев В.П., 1997).

Следует заметить, что проблеме гибели клетки учеными уделялось значительно меньше внимания, чем другим этапам жизненного пути клетки. И это, несмотря на то, что первые высказывания о существовании процесса гибели клеток в многоклеточном организме появились еще в конце XIX века. Однако годом признания апоптоза (с греческого apoptosis – опадание) как физиологического явления, считается 1972 год, когда английские исследователи Kerr, Wyllie, Currie представили убедительные морфологические доказательства существования этого явления.  И с тех пор апоптоз  является одной из центральных проблем биологии клетки и интенсивно изучается во всем мире.

Актуальность проблемы заключается в возможности коррекции этого процесса при различных заболеваниях. Известно, что запуск ПКГ осуществляется как специфическими сигналами (цитокинами, гормонами), так и неспецифическими (радиация, гипертермия, окислительный стресс). Причем, может происходить как индукция апоптоза, так и его супрессия.

По мнению некоторых авторов, ПКГ – один их типов апоптоза (Фаллер, 2003); и ее можно рассматривать как смерть, наступающую в результате срабатывания в клетке внутренних сигналов, а апоптоз — индуцируется внешними, например, вредными веществами. Эти сигналы вызывают активацию генов смерти и могут появляться вследствие срабатывания различных механизмов. Некоторые из этих механизмов запрограммированы, другие – нет.

Апоптоз появляется в течение эмбрионального развития, особенно в комплексе органов, где субпопуляция клеток избирательно уничтожается. Например, многие нейроны погибают внутри развивающегося мозга и «самореактивные» лимфоциты элиминируются внутри тимуса. Нарушение апоптоза в эмбриогенезе может приводить к внутриутробной гибели плода, врожденным уродствам или различным заболеваниям, в том числе злокачественным.

У взрослых апоптоз может быть определен особенно в тканях, подвергнутых обратимому расширению, например, в гормонзависимых клетках груди и простаты после оперативного лечения гормональной опухоли.

Можно выделить два направления в изучении апоптоза. С одной стороны, исследуются существующие сигнальные и рецепторные пути, регулирующие апоптоз. Эти данные можно использовать, применяя эндогенные медиаторы. С другой стороны, ведется поиск веществ, способных направленно воздействовать на процессы апоптоза, подавляя или активируя его.

Критерии апоптоза

Большинство исследователей выделяют сейчас две основные формы клеточной гибели: апоптоз и некроз. Несмотря на неоднозначность признаков той или иной формы, существуют общепризнанные критерии апоптоза морфологического и молекулярно-биохимического характера. К первым относится целостность плазматической мембраны, конденсация хроматина, набухание митохондриальной мембраны. Остатки клетки фагоцитируются макрофагами или соседними клетками, поэтому клеточное содержимое не попадает в межклеточное пространство и не вызывает воспалительной реакции. При некрозе клетки набухают, их митохондрии и другие органеллы расширяются и разрываются внутриклеточные и плазматическая мембраны клетки. В результате этого активируются лизосомальные ферменты, а внутриклеточное содержимое, попадая во внеклеточную среду, вызывает воспалительные процессы. Классические причины, приводящие к некрозу клетки – гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксия, действие комплемента или различных токсинов.

Среди молекулярно-биохимических признаков апоптоза важнейшим является его энергозависимость, в отличие от некроза. Т.е., апоптоз требует обязательного наличия АТФ, изменение его уровня может определить направление клеточной гибели, причем решающим может являться даже не абсолютное содержание АТФ, а отношение АТФ/АДФ в клетке.  Другим характерным признаком служит расщепление ядерной ДНК и формирование фрагментов, кратных 200п.н., что приводит к формированию известных «лестниц» ДНК на электрофореграмме; при развитии другого пути апоптоза ДНК может расщепляться на более крупные фрагменты. На ранних стадиях апоптоза клетка сморщивается, теряя до 1/3 своего объема за несколько минут. Третий важный биохимический маркер ПКГ — активация специфических цистеиновых протеаз (каспаз) и, соответственно, деградация белка в клетке. Каспазы разрезают белок специфично за остатком Asp. И, наконец, появление фосфатидилсерина на поверхности клетки (и апоптотических телец, образующихся из нее) способствуют их узнаванию макрофагами и фагоцитозу. Клетка на данном этапе еще живая (включения летального красителя трипанового синего не происходит). Видимо в этом и есть задача апоптоза – утилизация еще живых апоптозных телец, пока содержимое клетки не попадет во внеклеточную среду.

Участие митохондрий в развитии апоптоза

В настоящее время доказана первостепенная роль митохондрий для многих, если не для всех видов апоптоза.  В первую очередь происходит падение трансмембранного потенциала Dy на внутренней мембране митохондрий. Деполяризация – общая черта апоптоза  для большинства типов клеток (нейроны, фибробласты, моноциты, лимфоциты, гепатоциты, различные опухолевые клетки и т.д.). Затем происходят более глубокие изменения проницаемости митохондриальных мембран: образуются гигантские поры (мегаканалы – permeability transition pore (PTP)). Точный состав этой поры, несмотря на длительное изучение, не известен. Тем не менее, поровой комплекс содержит множество мишеней для внешнего воздействия и регулируется множеством эндогенных физиологических факторов. Среди них: оксид азота; активные формы кислорода; концентрация ионов (Ca2+ и Mg2+); изменения Dy; концентрация адениновых нуклеотидов (АДФ, АТФ), липидов, определенных белков; изменения в составе Bcl-2 комплекса. Судя по всему, гигантская пора интегрирует различные ответные реакции клетки на стресс, и почти все процессы клеточной гибели вызывают изменения митохондриальной проницаемости.

Как уже было отмечено, важным компонентом индукции апоптоза во многих типах клеток является свободный цитоплазматический кальций. Вследствие связывания лигандов с различными поверхностными рецепторами клетки происходит активация различных изоформ фосфолипазы С. Вслед за этим образуются вторичные мессенджеры, например, диацилглицерол и инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3).

Диацилглицерол активирует семейство сериновых и треониновых киназ, известных в целом как протеинкиназа С (РКС). IP3 стимулирует высвобождение ионов кальция из внутриклеточных депо. Более того, некоторые химические токсины могут стимулировать апоптоз путем нарушения нормального гомеостаза кальция.

Причины апоптоза

Этот феномен является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, гамма- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др. Во всех этих случаях происходит индукция апоптоза, но при увеличении дозы соответствующего агента развивается некроз клетки. Поскольку апоптоз физиологическое явление, то в организме должны быть факторы, приводящие к ПКГ. В настоящее время известно, что таковыми могут быть как внутриклеточные сигналы, так и внешние, опосредующие свое действие через рецепторные системы, которые сами по себе не являются токсическими или деструктивными.

Среди физиологических наибольший интерес вызывают гормоны. Известно, что они могут выступать как индукторами, так и ингибиторами гибели клетки в зависимости от стадии ее дифференцировки (например, половые гормоны). Центральное место в исследовании апоптогенного действия гормонов принадлежит изучению влияния глюкокортикоидов (ГК) на лимфоидные клетки. Чувствительность Т-клеток к ГК зависит от стадии развития лимфоцитов. Пре-Т-клетки костного мозга и незрелые Т-клетки тимуса чувствительны к физиологическим дозам  ГК. Определенные субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов (натуральные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты) претерпевают апоптоз под действием ГК. Также гибнут пре-В-клетки и незрелые В-клетки. Зрелые В-лимфоциты не чувствительны к ГК.

Другим физиологическим регулятором ПКГ являются цитокины (обширная группа белков, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток при связывании со специфическими рецепторами на клетках-мишенях). Цитокины  подразделяются на три большие группы (в зависимости от структуры и функции): ростовые факторы, семейство Фактора некроза опухоли и спиральные цитокины (интерлейкины, интерфероны). Эффект цитокинов на клетки также неоднозначен: для одних клеток они выступают в роли индуктора, для других – в роли ингибитора апоптоза. Это зависит от типа клетки, стадии ее дифференцировки и фукционального состояния. Наличие в организме физиологических факторов — индукторов и ингибиторов апоптоза — позволяет сделать вывод, что ПКГ зависит от соотношения этих регуляторов.

Трансляция сигнала

Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетку к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства ФНО со специфическими рецепторами. Ярким представителем этой группы белков является система Fas/Fas-L. Взаимодействие Fas с Fas-L(лиганд) приводит к апоптозу клетки. Человеческий Fas состоит из 325 аминокислотных (АК) остатков и относится к мембранным белкам I типа. Т.е. в его структуре можно выделить внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены. Примерно 80 АК-х остатков образуют домен смерти (DD), который вовлекается в белок-белковое взаимодействие, генерируя сигнал смерти. Ген Fas у человека локализован в длинном плече 10 хромосомы и состоит их 9 экзонов.

Fas-L является цитокином из ФНО-семейства, экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах, а также на клетках Сартоли и паренхиматозных клетках передней камеры глаза, что позволяет эти клеткам убивать любую Fas-экспрессирующую клетку, в том числе и активированный Т-лимфоцит. Этот механизм определяет появление защищенных от иммунной системы мест.

При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков: (1) DD (домен смерти), относящийся к рецептору, (2) адапторного белка – FADD (Fas-ассоциированный домен смерти), содержащий DED – эффекторный домен смерти и (3) прокаспазы-8. В результате этого процесса происходит активация апоптоз-специфической протеазы – каспазы-8 и развиваются характерные для апоптоза процессы. Мутации в гене fasили в гене fas-L приводят к развитию аутоиммунных заболеваний.

Каскадный механизм апоптоза

В настоящее время складывается впечатление о центральной роли протеаз в запуске и развитии процесса апоптоза. Это цистеиновые протеазы, катализирующие необратимые специализированные реакции протеолиза, — каспазы. Обнаружено 10 каспаз, образующих ферментативный каскад. Среди каспаз различают эффекторы, т.е. ферменты непосредственно гидролизующие структурные белки клетки, и индукторы – каспазы, которые принимают апоптотический сигнал и передают его на эффекторные каспазы. Среди молекулярных мишеней каспаз – эффекторов известны многие белки, деградация которых вызывает развитие необратимых процессов, характерных для апоптоза. Регуляция активности каспаз в интактной клетке происходит тремя путями: 1) взаимодействие индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы 8 в Fas/Fas-L системе); 2) активация каспазы 9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Bcl-2; 3) активация каспаз при помощи гранзимов В-сериновой протеазы (в случае воздействия на клетку цитотоксических Т-лимфоцитов, например).

Фрагментация ДНК – ключевое событие апоптоза. Пусковым механизмом ее является протеолитическое расщепление каспазами важного для поддержания структурно-функциональной способности ДНК белка — топоизомеразы II. Также субстратом протеаз при апоптозе является гистон Н1, который защищает ДНК от действия эндонуклеаз. Осуществление различных этапов деградации ДНК связано с проявлением активности различных эндонуклеаз.

Роль белков p53 и семейства Bcl-2 в регуляции апоптоза клетки

В индукции ПКГ важная роль принадлежит белку p53. Этот белок с молекулярной массой 53 кД локализован в ядре клетки и является одним из регуляторов апоптоза. На ранних стадиях повреждения ДНК повышается его экспрессия, вызывая блок клеточного цикла в фазе G1 и  G2 до репликации ДНК и митоза, соответственно делая возможной репарацию поврежденной ДНК и предотвращая тем самым появление мутантных клеток. Если же активность репарационных систем недостаточна и повреждения ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется ПКГ, что приводит к защите организма от присутствия клеток с поврежденной ДНК.

Процесс регулированной клеточной гибели условно может быть разделен на несколько различных фаз: фаза инициации апоптоза, проведение сигнала, активация каспаз, активация эндонуклеаз и специфическая деградация ДНК, в результате чего наступает гибель клетки. Если начальные фазы различаются в зависимости от типа клеток и от апоптоз-индуцирующего сигнала, то этап деградации ДНК – универсален для большинства клеток. Эта фаза является переходом к необратимой – терминальной стадии апоптоза, которую контролируют белки семейства Bcl-2, производные одноименных генов. К настоящему времени известно, что белки этого семейства относятся либо к индукторам апоптоза (Bad, Bax, Bak и т.д.), либо к ингибиторам (Bcl-2, Bcl-X/L). Белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образую гомо- и гетеродимеры, что в конечном счете влияет на развитие апоптоза клеток. Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяют реостат жизни и смерти клетки.

Апоптоз при патологических состояниях

Апоптотическая гибель клеток наблюдается при различных патологических состояниях. Этим путем осуществляется гибель клеток в эндокринно-зависимых тканях, при уменьшении концентрации соответствующего гормона (например, клеток простаты после кастрации и коры надпочечников после подавления синтеза АКТГ глюкокортикоидами). Гибель клеток путем апоптоза происходит также при уменьшении кровоснабжения органа (ишемическая болезнь сердца). Интенсивно изучается роль апоптоза в детерминации сердечной недостаточности (СН). Специфические рецепторы клеточной гибели FAS/APO-1 широко представлены практически во всех клеточных структурах. Обнаружено увеличение рецепторной экспрессии в лимфоцитах и миокардиоцитах больных СН, что сочеталось с повышением их апоптозного индекса (Визир В.А, Березин А.Е., 2002).

На модели пневмоинфекции показано (Dockrell DH et al, 2003), что апоптоз альвеолярных макрофагов уменьшает распространение инфекции, в то время, как угнетение каспазной активации приводит к учащению бактериемий.

Индукция апоптоза иммунных клеток (Murphy FJ et al, 2003)  – механизм, успешно применяемый организмом для купирования нарушений в иммунной системе. Применяемые гомеостатические механизмы тщательно идентифицированы. Экспрессия фосфатидилсерина на поверхности апоптотических нейтрофилов достаточна, чтобы ограничить иммунный ответ на острое воспаление, тогда как апоптоз эффекторных клеток может ограничить ответ при хроническом воспалении.

Апоптоз при ожогах и сепсисе

Повреждения ДНК визуализируются в тканях в течение шока, сепсиса и других критических медицинских состояниях (Didenko VV etal, 1999). Предыдущие исследования авторов выявили увеличение апоптозов в коре надпочечников у доноров, перенесших тяжелую травму перед смертью, что послужило основанием для аналогичного обследования в эксперименте по моделированию критических состояний у крыс. Определяли число апоптозов и экспрессию mRNAp21 (ядерного протеина). У всех животных продемонстрированы схожие изменения: повреждения ДНК и компенсаторное усиление индукции p21, однако, выраженные в меньшей степени, чем у доноров. Тем не менее,  авторы указывают на неспецифичность инициации патогенеза повреждения, провляющегося в схожих реакциях, и рекомендуют изучать роль тканевых изменений ДНК и медиатора ответа на это повреждение - p21.

Септический шок связан с нейронным и глиальным апоптозом, который индуцируется экспрессией эндотелиальной растворимой нитридоксидсинтeтазы (iNOS) (Sharshar T et al, 2003).

Последние исследования продемонстрировали активацию ДНК-фрагментации скелетных мышц при различных патологических состояниях Almendro V et al (2003). Автор пытался выяснить, связан ли катаболизм при сепсисе с апоптозом мышечных клеток. Оказалось, что введение ингибитора синтеза TNF-a явно предупреждало фрагментацию ДНК миоцитов.

При сепсисе индуцируется апоптоз лимфоцитов, лежащий в основе иммуносупрессии. Продемонстрировано значительное уменьшение веса тимуса и увеличение фрагментации ДНК с характерной ДНК–лестницей на гелевой электрофореграмме в эксперименте при  моделировании перитонеального сепсиса. Показано усиление апоптоза тимоцитов in vitro у опытных крыс. Авторы связывают это, в частности, с ингибированием экспрессии IL-2 гена (Barke RA et al, 1994).

Позже установлено, что ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации лимфоцитов и  их гибели при сепсисе играет серин-треониновая киназа Akt. Определено, что сверхэкспрессия этого фермента в лимфоцитах предупреждает апоптоз лимфоцитов и улучшает выживаемость мышей при сепсисе. Т.о., намечен принципиально новый подход в терапии этого критического состояния (Bommhardt U et al, 2004).

В настоящее время имеется большое число работ, посвященных исследованию состояния системы Fas/Apo-1, как универсального рецепторного механизма апоптоза.

Nakae H. с соавт. (2001) изучали изменения в системе Fas/FasLпри острой печеночной недостаточности (I группа) и сепсисе без выраженного гепатоцеллюлярного поражения (II группа). Оказалось, что уровень sFasL   был значительно выше у пациентов I группы. Выявлена значительная корреляция между TNF-a, sFas и отрицательная – между TNF-a и sFasL. Авторы приходят к выводу, чтоTNF-a и sFasL, в особенности, могут играть гепатопротекторную роль.

Уменьшение воспаления включает удаление нейтрофилов и других воспалительных клеток путем индукции апоптоза. Fas/Apo-1 экспрессируется любым типом клеток и может проявляться в растворимой циркулирующей форме. В своем исследовании Torre D etal (2003) определяли уровень циркулирующих Fas/Apo-1 у пациентов с системным воспалительным ответом (SIRS): 57 больных с сепсисом и септическим шоком и 23 с неинфицированным SIRS. Результаты ясно показали значительное повышение уровня растворимой рецепторной формы у пациентов с SIRS: 10.4±8.1 пг/мл по сравнению с контролем: 5.0±0.7 пг/мл р< 0.0001. Причем, не имело значение инфицирование. По-видимому, это отражение общего механизма, связанного с накоплением нейтрофилов в случае воспаления/инфекции.

В свою очередь, Chung CS et al (2001), подтверждая  важную роль системы Fas/FasL как индуктора апоптоза в развитии нарушений органной перфузии при сепсисе, демонстрируют  противоположные результаты. Дефицит FasL обеспечивает выживание  мышей, подвергнутых полимикробному сепсису. Изучение взаимосвязи этой системы с развитием полиорганной недостаточности (ПОН) производилось путем введения ингибитора Fas (FasFP)  и исследованием системного и локального кровотока, а также биохимических маркеров ПОН. Результаты показали, что введение ингибитора трансляции сигнала клеточной смерти является новой терапевтической моделью для поддержания органной перфузии и предохранения повреждения печени при сепсисе.

Продолжая работу в данном направлении, Chung CS et al (2003) исследовал влияние ингибирования Fas/FasL на апоптоз макрофагов и функциональную способность перитонеальных, селезеночных и Купферовых клеток от септических мышей. Результаты показали, что введение ингибитора сразу после развития сепсиса или спустя 12 час улучшают выживаемость животных. Способность макрофагов выделятьIL-6 была значительно снижена, а высвобождение IL-10 – повышено. Однако, FasFP ослаблял продукцию IL –10 в Купферовых клетках и не влиял на перитонеальные и селезеночные. Далее, ингибитор ослаблял повышенный плазменный уровень печеночных энзимов. Т.е., эти данные демонстрируют общий положительный эффект in vivo и неодназначный – in vitro.

Термическая травма приводит к усилению печеночного апоптоза и  пролиферации, связанной с экспрессией ядерного фактораNF-kappaB (Jeschke MG  et al, 2001). В эксперименте на крысах при термическом ожоге 40% поверхности тела у крыс изучали апоптоз и пролиферацию печеночных клеток на 1, 2, 5 и 7 сут после ожога. Показано, что апоптоз и клеточная полиферация усилены во все сроки по сравнению с контролем на фоне снижения синтеза белка.

Известно, что при термическом поражении происходит резкое возрастание белкового катаболизма, особенно в скелетной мускулатуре.Tisdale MJ (2002) изучал пути индукции этого процесса на клеточном уровне. Выяснилось, что протеиновая деградация в условиях катаболического состояния первично запускается активацией протеосомно-протеолитической трансцеллюлярной системы. Глюкокортикоиды непосредственно активируют эту систему. При онкопатологии срабатывает другой пусковой механизм: опухолью вырабатывается протеолизиндуцирующий фактор (сульфогликопротеин), повышающий катаболизм мышечного белка. Причем, индукция экспрессии протеосомных субъединиц глюкокортикоидами является результатом снижения активности ядерного фактора – kappa B. Апоптоз может также играть существенную роль в потерях белка  на первых стадиях кахексии.

В экспериментальной работе по моделированию эндотоксинового шока у свиней через 6ч продемонстрировано усиление апоптоза  в печени и селезенке на фоне  уменьшения содержания Bcl-2, в то время как почки оставались интактными (Haendeler J et al, 1996).

Стремление диагносцировать сепсис в более ранние сроки приводит к глубокому и обширному изучению генетических нарушений. Prucha M. et al, (2004) предприняли попытку исследования экспрессии генов у септических больных. Авторы проанализировали образцы цельной крови, используя микроструктуру 340 генов, задействованных в развитии воспаления. Обнаружена высокая гомогенность экспрессии генов пациентов (69%). Причем, положительное прогностическое значение выявлено в 98% по 50 различным генам, подтвержденным случайной выборкой транскрипции методом ПЦР. Т.е., впервые представлены данные по профилю экспрессии генов при  сепсисе. Принцип мультипараметрового исследования может быть адаптирован для ранней диагностики сепсиса.

Проводятся исследования по выявлению различий в экспрессии генов при грам-положительном и грам-отрицательном сепсисе (Yu SLet al, 2004). Выяснено, что большинство генов с поврежденной экспрессией были общими при развитии любого сепсиса, однако, экспрессии 17 генов были различными у обоих типов сепсиса, в особенности,  после инфицирования. Кроме более глубокого понимания патогенеза, эти данные могут помочь определить новые маркеры сепсиса и выработать новую терапевтическую стратегию.

Несмотря на многочисленные исследования, демонстрирующие усиление апоптоза  при сепсисе, имеются и противоположные данные. Например, касательно нейтрофилов. Известно, что уменьшение нейтрофил-медиированного воспаления происходит посредством апоптоза полиморфноядерных нейтрофилов (ПМН). При изучении нейтрофильного апоптоза Taneja R et al. (2004) пришли к выводу о глубокой супрессии программируемой  гибели этих клеток при сепсисе. Они оценивали каспазную экспрессию, активность ядерного фактораkappa-B, изменения трансмембранного митохондриального потенциала  и активность нейтрофилов от септических больных и здоровых добровольцев. В основе угнетения, по их мнению, — активация ядерного фактора, который связан со снижением активности каспаз –9 и –3 и сохранением трансмембранного потенциала митохондрий, что отличает ингибирование апоптоза от аналогичного при экспозиции здоровых нейтрофилов с воспалительными медиаторами.

Схожие результаты по ослаблению апоптоза путем активации ядерного фактора были получены ранее von Knethen A et al (1999) в условиях повышенного свободно-радикального процесса. Оказалось, что сублетальная генерация свободных радикалов репрограммирует макрофаги путем активации NF-kappa B и AP-1, вызывая циклооксигеназную экспрессию, ослабляющую, в свою очередь, нитрооксид-каспазную активность.

Большую ясность в этом вопросе вносит, на наш взгляд, работаMarsik C et al (2003), в которой авторы определяли влияние разных доз эндотоксина на экспрессию в системе Fas/FasL лейкоцитов в динамике. У здоровых добровольцев после инфузии эндотоксина через 2-4 часа в 15-20% случаев выявили снижение рецепторной экспрессии, также и in vitro. Однако, через 24 часа демонстрировалось рикошетное усиление экспрессии в системе Fas/FasL, как на нейтрофилах, так и растворимой формы в плазме крови. Кроме того, исследуя методом полимеразной цепной реакции экспрессию Fas mRNA (РНК), обнаружено 6-кратное ее усиление уже через 4-6 часов после введения токсина,  при этом в циркулирующих лейкоцитах FasL-mRNA была снижена в 80% случаев через 2 часа после токсемии. Резюмируя результаты своих исследований, авторы приходят к выводу, что изменения в передаче сигнала клеточной гибели зависят от дозы эндотоксина: низкие дозы индуцируют раннюю сниженную модуляцию Fas  на лейкоцитах, последующее 6-кратное усиление экспрессии mRNA, приводящее к поздней сверхрегуляции на нейтрофилах. В итоге, сверхрегуляция Fas экспрессии, Fas mRNA и поздней Fas L (лиганда) и sFas (растворимой формы)  приводят к усилению уровня апоптоза у септических пациентов.

По предварительным результатам проводимых нами в настоящее время исследований по определению апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов (методом однонитевых разрывов ДНК) у пациентов с термической травмой разной степени тяжести — также складывается впечатление о «дозозависимости». На ранних сроках после травмы определяется резкое увеличение разрывов, причем, преимущественно нейтрофилов. При увеличении степени поражения  количество их продолжает расти. Однако, у крайне тяжелых больных, находящихся в отделении интенсивной терапии в те же сроки (до 14 сут после травмы) и тем более, позже, — отмечается резкое снижение процента повреждений ДНК. Планируется продолжение исследований в этой области на более глубоком и современном уровне.

Заключение.

Таким образом, апоптоз является общебиологическим  механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеточных популяций, а также формообразование и выбраковку дефектных клеток. Нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, ингибированием апоптоза. И, напротив,  заболевания, особенно критические (сепсис), приводят к выраженной патологии апоптоза, влекущей за собой развитие иммунодефицита, анемии, полиорганной недостаточности и т.д.    Следовательно, изучение механизмов регуляции  данного процесса при различной патологии позволит определенным образом воздействовать на отдельные его этапы с целью их коррекции.

В частности, Murphy FL et al (2003) исследует эти механизмы в популяции иммунных клеток. Индукция апоптоза иммунных клеток  – механизм, успешно применяемый организмом для купирования нарушений в иммунной системе. Применяемые гомеостатические механизмы тщательно идентифицированы. Экспрессия фосфатидилсерина на поверхности апоптотических нейтрофилов достаточна, чтобы ограничить иммунный ответ на острое воспаление, тогда как апоптоз эффекторных клеток может ограничить ответ при хроническом воспалении. Другой терапевтический подход включает ингибирование апоптоза путем блокирования каспазного каскада. Этот метод будет особенно уместен для лечения заболеваний ЦНС и сепсиса. Альтернативный путь скорого разрешения процесса – индукция апоптоза эффекторных клеток посредством медиаторной активации Fas-рецепторов.

В настоящее время общепринято: если клетка погибает от апоптоза – подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза, – нет. Осознание роли апоптоза в гибели клеток интенсифицировало поиск средств, защищающих их от апоптоза. Активно изучаются ингибиторы специфических протеаз в качестве фармакологических агентов. Это, как правило, три- или тетрапептиды, содержащие аспарагин. Многообещающими являются также подходы, связанные с регуляцией апоптоз-специфических генов.Идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза должна в перспективе способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний, улучшению дифференциальной диагностики и созданию принципиально новых направлений терапии.

 

Список использованной литературы.

 

1. Almendro V, Carbo N, Busquets S, Figueras M, Tessitore L, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM/Sepsis induces DNA fragmentation in rat skeletal muscle/Eur Cytokine Netw. 2003 Oct-Dec;14(4):256-9.
2.  Barke RA, Roy S, Chapin RB, Charboneau R/The role of programmed cell death (apoptosis) in thymic involution following sepsis/Arch Surg. 1994 Dec; 129(12):1256-61; discussion 1261-2.
3. Bommhardt U, Chang KS, Swanson PE, Wagner TN, Tinsley KW, Karl IE, Hotchkiss RS/Akt decreases lymphocyte apoptosis and improves survival in sepsis/J Immunol. 2004 Jun 15; 172(12):7583-91.
4. Chung CS, Yang S, Song GY, Lomas J, Wang P, Simms HH, Chaudry IH, Ayala A /Inhibition of Fas signaling prevents hepatic injury and improves organ blood flow during sepsis/Surgery.2001 Aug; 130(2):339-45.
5. Chang CS, Song GY, Lomas J, Simms HH, Chaudry IH, Ayala A/Ingibition of Fas/Fas ligand signaling improves septic survival: differential effects on macrophage apoptotic and functional capacity/J Leukoc Biol. 2003 Sep;74(3):344-51.
6. Didenko VV, Wang X, Yang L, Hornsby PL/DNA damage and p21 (WAF1/CIP1/SDI1) in experimental injury of the rat adrenal cortex and trauma-associated damage of the human adrenal cortex/J Pathol. 1999 Sep; 189(1):119-26.
7. Dockrell DH, Marriott HM, Prince LR, Ridger VC, Ince PG, Hellewell PG, Whyte MK/Alveolar macrophage apoptosis contributes to pneumococcal clearance in a resolving model of pulmonary infection/J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):5380-8.
8. Finney SJ, Evans TW/Induction of apoptosis in sepsis: cell suicide may be benefical/Crit Care Med. 2002 Jan;30(1):261-2.
9. Finnerty CC, Herndon DN, Chinkes DL, Jeschke MG. /Serum cytokine differences in severely burned children with and without sepsis// Shock. – 2007 Jan. – N 27(1). – P. 4-9.
10. Haendeler J, Messmer UK, Brune B, Neugebauer E, Dimmeler S./Endotoxic shock leads to apoptosis in vivo and reduses Bcl-2/Shock.1996 Dec;6(6):405-9.
11. Haslett Ch., Savill J./Why is apoptosis important to clinicians?/bmj.com Haslett and Savill 322 (7301): 1499.
12. Huang Q, Xu W, Ustinova E, Wu M, Childs E, Hunter F, Yuan S/Myosin light chain kinase-dependent microvascular hyperpermeability in thermal injury/Shock. 2003 Oct;20(4):363-8.
13. Jeschke MG, Low JF, Spies M, Vita R, Hawkins HK, Herndon DN, Barrow RE/Cell proliferation, apoptosis, NF-kappaB expression, enzyme, protein, and weight changes in livers of burned rats/Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001 Jun; 280(6):G1314-20.
14. von Knethen A, Callsen D, Brune B/Superoxide attenuates macrophage apoptosis by NF-kappa-B and AP-1 activation that promotes cyclooxygenase-2 expression/J Immunol. 1999 Sep 1; 163(5):2858-66.
15. Marsik C, Halama T, Cardona F, Wlassits W, Mayr F, Pleiner J, Jilma B/Regulation of Fas (APO-1, CD95) and Fas ligand expression in leukocytes during systemic inflammation in humans/Shock. 2003 Dec;20(6):493-6.
16. Mary K.L. Collins and Abelardo Lopez Rivas/The control of apoptosis in mammalian cells/Trends Biochim.Sci.1993-v18, p307-309.
17. Murphy FJ, Hayes I, Cotter TG/Targeting inflammatory diseases via apoptotic mechanisms/Curr Opin Pharmacol. 2003 Aug;3(4):412-9.
18. Nakae H, Narita K, Endo S/Soluble Fas and soluble Fas ligand levels in patients with acute hepatic failure/J Crit Care.2001 Jun; 16(2):59-63.
19. Pallua N, Low JF, von Heimburg D. Pathogenic role of interleukin-6 in the development of sepsis. Part II: Significance of anti-interleukin-6 and anti-soluble interleukin-6 receptor-alpha antibodies in a standardized murine contact burn model// Crit Care Med. – 2006 May. – N 31 (5). – P. 1495-1501.
20. Ptucha M, Ruryk A, Boriss H, Moller E, Zazula R, Herold I, Claus RA, Reinhart KA, Deigner P, Russwurm S./Expression profiling: toward an application in sepsis diagnostics /Shock.2004 Jul;22(1):29-33.
21. Sharshar T, Gray F, Lorin de la Grandmaison G, Horkinson NS, Ross E, Dorandeu A, Orlikowski D, Raphael JC, Gajdos P, Annane D/Apoptosis of neurons in cardiovascular autonomic centers triggered by inducible nitric oxide synthase after death from septic shock/Lancet. 2003 Nov29;362(9398):1799-805.
22. Taneja R, Parodo J, Jia SH, Kapus A, Rotstein OD, Marshall JC /Delayed neutrophil apoptosis in sepsis is associated with maintenance of mitochondrial transmembrane potential and reduced caspase-9 activity/Crit Care Med. 2004 Jul;32(7):1460-1469.
23. Tisdale MJ./Biochemical mechanisms of cellular catabolism/Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2002 Jul;5(4):401-5.
24. Torre D, Tambini R, Manfredi M, Mangani V, Liivi P, Maldifassi V, Campi P, Speranza F/Circulating levels of FAS/APO-1 in patients with systemic inflammatory response syndrome/Diagn Microbiol Infect Dis. 2003 Apr;45(4):233-6.
25. Wallach D/Cell death induction by TNF: a matter of self control/Trends in Biochemical Sci. 1997. v.22. N4. p.107-109.
26. Yu SL, Chen HW, Yang PC, Peck K, Tsai MH, Chen JJ, Lin FY/Differential Gene Expression in Gram-Negative and Gram-Positive Sepsis/Am J Respir Crit Care Med. 2004 Mar 4.
27. Zhang F, Hu EC, Gerzenshtein J, Lei MP, Lineaweaver WC. The expression of proinflammatory cytokines in the rat muscle flap with ischemia-reperfusion injury// Ann Plast Surg. – 2005 Mar. – N 54(3). – P. 313-317.
28. Визир В.А., Березин А.Е./Иммунно-воспалительная активация как перспективная концептуальная модель формирования и прогрессирования сердечной недостаточности/http://www.therapy.zp.ua/sn/sn2/view/1.htm.
29. Голубев А.М., Москалева Е. Ю., Северин С.Е., Веснянко Т.П., Кузовлев А.Н., Алкадарский А.С., Порошенко Г.Г. /Апоптоз при критических состояниях // Общая реаниматология. – 2006. – N11. – С. 5-6.
30. Плотников Е.Ю./Изучение цитотоксической активности донора оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана на экспериментальной модели клеток опухолевой линииhela/http://1.cellimm.bio.msu.ru/groups/kvf/egor.html.
31. Роль апоптоза в патогенезе заболеваний/http://biochemistry.vov.ru/apoptosis.html.
32. Фаллер Д.М., Шилдс Д./Молекулярная биология клетки/М. 2003.
33. http://biochemistry.vov.ru./apoptos/apoptosis.html